Test Microbioma Pet

Il prelievo fecale viene fatto a partire da feci fresche, appena emesse, per evitare che la composizione microbica si alteri.

Nel kit TMP è presente un cotton fioc, che viene immerso nelle feci per prelevare una quantità pari a un chicco di riso. Il cotton fioc viene poi inserito nel tubo incluso nel kit e immerso nel liquido di conservazione che questo contiene. 

Una volta sciolto bene il materiale fecale nel liquido, le pareti dei microbi si rompono e ne fuoriesce il DNA, che poi è stabile a temperatura ambiente per alcune settimane.
Il tubo viene inviato al laboratorio.

Il tubo contenente il DNA microbico viene inserito nella linea di produzione del dato metagenomico.

In primo luogo si estrae il DNA purificato e una frazione di questo viene utilizzato per amplificare (PCR) la regione v3-v4 del gene batterico 16SrRNA, il cosidetto gene barcoding, la cui sequenza consente di riconoscere il batterio a cui appartiene.

Il rimanente viene conservato a -80°C. L'amplificato viene controllato e adeguatamente preparato per essere sequenziato.

Il sequenziamento avviene su Illumina Miseq e restituisce i file FASTQ.

Nella fase di pre-processing le sequenze di DNA contenute nel file FASTQ vengono verificate ed eventualmente scartate. Solo le sequenze di buona qualità vengono usate nella fase di analisi.

Attraverso una pipeline proprietaria che integra il software Qiime, ogni variante (ASV o amplicon sequence variant) viene contata e confrontata con uno specifico database (Greengenes) in cui sono contenute tutte le sequenze precedentemente pubblicate dai ricercatori, a cui è associato la tassonomia del batterio a cui appartiene.

L'ultimo passo prevede il confronto con una popolazione sana di riferimento.

Al termine del processo si ottiene la composizione della frazione batterica del microbioma a confronto con una popolazione sana che consente di valutare eventuali stati alterati del microbioma.